Polikistik over sendromu (PKOS)
1990 National Institutes Of Health (NIH) kriterlerine göre doğurganlık dönemindeki kadınların %6.5-8’inde PKOS görülmektedir (54). Oysa 2003 Rotterdam kriterlerine göre yapılan prevelans çalışmalarında bu oranın 2-3 kat daha fazla olduğu bildirilmektedir (61). NIH 1990 ve Rotterdam 2003 kriterlerine göre PKOS prevelansını kıyaslayan daha çok çalışmaya ihtiyaç vardır (54).
Obezite, insülin direnci, Tip II Diabetes Mellitus (T2DM) ve oligo-ovulatuvar infertilite gibi durumlar artmış PKOS prevelansı ile birliktedir. PKOS’ lu kadınların
%40-50’si obez (53, 76), en az %50’ sinde insülin direnci (34), %25-30’unda bozulmuş
glikoz toleransı (74) ve %8’ inde T2DM görülmektedir (74). Normal kadınların %16- 25’inde başka hiçbir bulgu olmadan PKO vardır (2, 93). Anovulasyonu olan kadınların ise % 75’inde PKO görülmektedir(63).
KLİNİK BULGULAR:
PKOS genellikle peripubertal dönemden itibaren başlayan menstrual düzensizlikler (oligomenore, amenore, disfonksiyonel uterus kanaması), hiperandrojenizm bulguları (hirsutizm, akne, ciltte yağlanma, androjenik alopesi) ve infertilite ile karşımıza çıkmaktadır. Obezite kliniğe eşlik edebilir. Fizik muayenede nadiren virilizasyon bulguları ve akantozis nigrikans saptanabilir. PKOS’ lu olgularda
%20’ lere ulaşan sıklıkta adetlerin düzenli olabileceği de bildirilmiştir (52). Erken yaşlarda daha sık menstrual düzensizlikler görülmekte olup, daha ileri yaşlarda ise hirsutizm ve infertilite ön plana çıkmaktadır.
Hirsutizm: PKOS’ un en belirgin klinik belirtisi hafiften şiddetliye kadar değişebilen hirsutizmdir. Hirsutizm modifiye Ferriman-Gallwey (FG) metodu ile değerlendirilir (60). Bu metod ile üst dudak, çene, göğüs bölgesi, sırtın alt ve üst kısımları, alt ve üst karın, kol ve bacakların üst kısımları olmak üzere toplam 9 alanda kıl dağılımı 0-4 arasında skorlandırılarak toplam FG skoru ≥ 6 hirsutizm olarak tanımlanır. Kılların büyüme hızı klinik olarak önemlidir, yavaş ve uzun süredir olması fonksiyonel etyolojiyi, oysa kalın ve koyu pigmentli kılların hızlı şekilde birden ortaya çıkması sıklıkla androjen üreten tümörü gösterir. PKOS’ da artmış kıl gelişimi genellikle yüzün yanlarında, üst dudak ve boyun bölgesine yayılacak şekilde çenededir. Gittikçe artan hiperandrojenizmde temporal saç dökülmesi ve erkek tipi kellik olabilir. Hipotiroidizm ve obezite gibi androjenlerin bioaktivitesini değiştiren durumlar da artan kıl büyümesine neden olabilir. Bu durumlar SHBG seviyesini düşürerek kullanılabilir serbest testosteronun artmasına neden olurlar.
Menstruel Düzensizlikler: PKOS’ da menstruel bozukluk düzensiz, seyrek veya menstruel kanamanın olmaması şeklindedir. Kanamanın zamanı önceden bilinemez. Kadınların yaklaşık %20’ sinde tam mens yokluğu vardır, hastaların %5-10’u ise düzenli ovulatuvar fonksiyon gösterir.
Sürekli Anovulasyonun Klinik Sonuçları:
İnfertilite
Amenoreden disfonksiyonel kanamaya kadar değişen menstruel kanama problemleri
Hirsutizm ve akne
Endometrium ve meme kanserinde artmış risk
Kardiovasküler sistem hastalıklarında artmış risk
Tip II DM’ de artmış risk
Obezite: PKOS’da obezite görülme sıklığı %40-60 olarak bildirilmektedir (52). Farklı ülkelerdeki PKOS hastalarında obezite prevalansı farklılık gösterebilir. Obezite sıklıkla bel/kalça oranının arttığı santral obezite tipinde olup PKOS’lu hastalara ek riskler getirmektedir (19). Normal vücut ağırlığına sahip PKOS hastalarında da ağırlık yönünden eşleştirilmiş sağlıklı kontrollere göre bel/kalça oranı artmıştır (88). 1982’de yapılan bir çalışmada, obez PKOS’lu hastaların %75’ de ağırlıklarının %10-15’ ni verdiklerinde spontan gebelik oluşmuş, bu sonuçlar daha sonraki çalışmalarla da doğrulanmıştır (15).
İnfertilite: Klasik olarak PKOS’da infertilitenin primer sebebi anovulasyondur. Anovulasyona neden olan LH hipersekresyonu ile infertilite arasındaki ilişki sanıldığından daha komplekstir. LH ayrıca bilinmeyen bir mekanizma ile erken gebelik kayıpları ile de ilişkili olabilir (12). Metforminle tedavi edilen kadınlarda ilk trimester gebelik kayıplarında önemli bir azalma gösteren çalışmalarda PKOS’da insülin direnci ile tekrarlayan gebelik kayıpları arasında muhtemel ilişki ileri sürülmüştür (51).
Akantozis Nigrikans: Epidermal hiperkeratozis ve dermal fibroblast proliferasyonu ile oluşan; en sık olarak ense, deri kıvrımları, dirsek ve vulvada görülebilen koyu, kadife plaklar şeklindedir (56, 62). Belirgin artmış pigmentasyona rağmen melanosit sayısında artma veya melanosit depolanması yoktur. Hiperinsülineminin varlığı ve şiddeti ile ilişkilidir(46, 105). PKOS’ da hiperinsülineminin azaltılması koyu deri bölgelerinde iyileşmeyi sağlar.
LABORATUVAR BULGULARI:
Sendroma tek başına tanı koyduracak bir biyokimyasal test henüz bulunmamaktadır.
LH/FSH oranı premenopozal kadınlarda 1:1 iken, PKOS’ lu kadınlarda bu değer 2:1’ den daha büyüktür.
FSH seviyesi normal veya normalin altındadır.
LH seviyesi artmıştır.
Total testosteron veya serbest testosteron düzeyleri artmıştır. Bu test en faydalı test olarak görülmektedir.
Prolaktin düzeyleri normal veya artmış bulunabilir.
DHEA-S düzeyleri çok az olarak artmış bulunabilir.
Östrojen seviyesi normal veya yüksek bulunur.
SHBG seviyesi azalmış bulunur.
Lipit profili: LDL-Kolesterol, Kolesterol ve Trigliserit düzeyleri artmış ve HDL düzeyi ise azalmış olarak bulunur.
Glikoz düzeyi armıştır.
İnsülin genellikle artmış bulunur.
Bu testlere ilaveten ultrason ve/veya laproskopi de tanı için kullanılmaktadır
Laboratuvar testleri ayırıcı tanı için de gereklidir. Amenore nedenlerini ekarte etmek için;
β-HCG (gebelik)
Prolaktin (hiperprolaktinemi)
TSH (tiroid disfonksiyonu)
Hiperandrojenizmin diğer sebeplerini ekarte etmek için:
DHEA-S
Androstenedion
17α OH progesterone
TANI KRİTERLERİ:
En yaygın olarak kullanılan tanı kriterleri 1990 yılında Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından düzenlenmiş bir konferansta oluşturulmuştur. Buna göre PKOS tanısı için klinik ve/veya biyokimyasal hiperandrojenizm ile kronik anovulasyon bulunması ve PKOS benzeri kliniğe yol açabilecek diğer nedenlerin (hiperprolaktinemi, tiroid bozuklukları, konjenital adrenal hiperplazi) ekarte edilmesi gereklidir (123).
Bu tanı kriterleri her ne kadar PKOS’ daki heterojen hasta grubu düşünüldüğünde arzulanan seviyede olmasa da, en azından tanı açısından belli bir standardizasyonu sağlamıştır. Ayrıca belirlenen bu tanı kriterlerinin klinik, biyokimyasal ve uzun dönem sağlık riskleriyle ilişkisini irdeleyen çok merkezli ve klinik birçok yeni çalışmaya da vesile olmuştur.
Ancak 2000’li yıllara gelindiğinde mevcut tanı kriterlerinin tüm olası PKOS klinik özelliklerini kapsamadığı ve mevcut tanısal kriterler ile uzun dönem sağlık riskleri arasında tam bir korelasyon kurulamadığı anlaşılmıştır. Tanısal kriterlerdeki bu yetersizlikler ve morfolojik veya klinik tanı kriterlerinden hangisinin daha baskın olduğuna yönelik tartışmalar sonunda bizleri 2003 yılında düzenlenen Rotterdamdaki ortak karar toplantısı aşamasına getirmiştir. Bu konsensus toplantısı tanı kriterleri açısından birbirinden farklılık gösteren ESHRE (Europen Society for Human Reproduction and Embryology) ve ASRM (American Society for Reproductive Medicine) gruplarının bir araya gelmesi ve ortak tanı kriterleri oluşturma çabalarının bir ürünü olarak da düşünülebilir.
2003 yılında Rotterdamda yapılan bu toplantıda 1990 NIH kriterleri yeniden gözden geçirilmiş ve öncekine benzer şekilde diğer etyolojik nedenler ekarte edildikten sonra sendrom tanısının aşağıdaki üç kriterden ikisinin birlikteliği ile koyulması önerilmiştir (96, 97).
Oligo-anovulasyon
Klinik ve/veya biyokimyasal hiperandrojenizm bulguları
Ultrasonda polikistik overler.
Bu kriterlere göre, 2 fenotip daha PKOS’ lu olarak kabul edildi. Bunlar:
PKO ve ovulatuvar disfonksiyonu olan, fakat androjen fazlalığının bulgusu olmayan kadınlar ile
PKO ve hiperandrojenizmi olup, ovulatuvar disfonksiyonu olmayan kadınlar (11).
Bu hastaların herbirinin PKOS için varsaydığımız uzun dönem risk faktörlerini taşıyıp taşımadığı, hepsine benzer medikal yaklaşımlarda bulunulup bulunulmayacağı bugün için net değildir. Dolayısıyla PKOS tanı kriterleri bakımından halen istenen ve arzu edilen seviyeye gelebilnek için daha ileri çalışmalara ve gözlemlere ihtiyaç vardır (10).
UZUN DÖNEM SAĞLIK RİSKLERİ:
Kronik anovulatuvar infertilitenin en sık nedeni olan PKOS; multisistemik, reprodüktif, metabolik bir sendrom olarak Tip II diabet, dislipidemi, kardiovasküler hastalıklar ve endometrium kanseri gibi uzun dönem sağlık riskleri taşıması nedeniyle günümüzde bir halk sağlığı problemi olarak ön plana çıkmaktadır.
İnsülin Direnci, Glikoz İntoleransı ve Tip II Diabet: PKOS’ da görülen uzun dönem komplikasyonların çoğu insülin direnci ile ilgili görülmektedir (37). İnsülin direnci hem zayıf hem de obez PKOS’ lu kadınlarda görülebilir (23, 24). İnsülin direnci makrovasküler hastalıkların güçlü bir habercisidir (13). İnsülin direncini belirlemede genellikle kullanılan açlık glikoz/açlık insülin oranıdır (71). Ancak glikoz intoleransını göstermek için bu yeterli olmayıp oral glikoz tolerans testi (OGTT) yapılmalıdır (76).
İnsülin direncine ek olarak PKOS’ lu kadınlarda β hücre disfonksiyonu da vardır (38, 106), ki bu da onları Tip II diabete yatkın hale getirir.
Yaş, artmış BMI, artmış bel çevresi, artmış bel/kalça oranı ve 1.dereceden yakınlarda diabet öyküsü PKOS’ da diabet risk faktörleri arasında sayılabilir (74).
PKOS Tip II diabet gelişimi için bağımsız bir risk faktörü olarak kabul edilmekte ve tüm PKOS hastalarında diabet yönünden tarama yapılması önerilmektedir. Glikoz homeostaz anormalliklerinin belirlenmesinde en iyi metod OGTT’ dir (121).
Son yıllarda yapılan bir çalışmada obez, PKOS’ lu kadınların %31’inde bozulmuş glikoz toleransı (IGT), en az %7.5’inde aşikar diabet bulunmuştur. Ek olarak obez olmayan PKOS’ lu kadınların %10.3’ nde IGT, %1.5’ i diabetli olup bu sonuçlar genel populasyonun 3 katına denk düşmektedir (74).
Yapılan çalışmalar gösteriyor ki PKOS’ lu kadınlar diabet için yüksek risk taşırlar ve bu risk farklı etnik gruplarda da birbirine benzerdir (74). Ayrıca genel populasyona göre hastalığa yakalanma riski daha erken yaşlarda olmaktadır (31, 36).
Lipid Profili ve Kardiovasküler Hastalık: Kalp hastalığına predispozisyon oluşturan birkaç risk faktörünün varlığına dayanarak PKOS’ lu kadınların kardiovasküler hastalık için genellikle artmış risk altında olduklarına inanılır. Bu faktörler bozuk glikoz toleransı, android obezite, hiperandrojenizm, dislipidemi ve hipertansiyondur. Yapılan bir çalışmada PKOS grubu normal kontrollerden anlamlı derecede daha yüksek total kolesterol, LDL kolesterol ve trigliserit seviyelerine sahip olduğu bulundu. Ayrıca HDL kolesterol ve ApoAI düzeyleri düşük seviyelerdedir. Lipid düzeyi değişikliklerinde en önemli rol oynayan faktörün hiperinsülinemi olduğu söylenmektedir (95). PKOS’ lu kadınlarda hepatik lipaz aktivitesinin artmasından dolayı büyük lipoprotein partiküllerinin daha küçük partiküllere dönüşümü artmaktadır. Bunlar da daha aterojenik özelliktedirler. Bu da bize HDL’ de azalma ve LDL’ de artmayı açıklamaktadır (90).
PKOS’ lu kadınlarda ayrıca fibrinolizisin güçlü bir inhibitörü olan plazminojen aktivatör inhibitörü (PAI) konsantrasyonu da artmıştır. Bu da tromboz eğilimini arttırıp miyokard infarktüsü (MI) gelişimi için kolaylaştırıcı bir faktördür (39, 113).
Yapılan retrospektif çalışmalarda kardiovasküler hastalık riskinin arttığını gösteren bulgular elde edilmiştir. 20-30 yıl önce ovaryan wedge rezeksiyonu ile tedavi edilmiş PKOS’ lu hastaların 4 kat daha fazla hipertansiyon tedavisi gördüğü, 7 kat daha fazla da diabet tanısı aldığı yapılan bir çalışmada gösterilmiştir (31).
Sonuç olarak, PKOS kardiovasküler hastalık açısından bir risk faktörü olarak değerlendirilmelidir.
Kanser: PKOS’ lu hastalarda kronik karşılanmamış östrojen etkisi endometriyal hiperplazi ve adenokarsinom riskini arttırabilecek özelliklerdir. Ancak PKOS hastalarında endometriyal kanser sıklığının ya da endometriyal kansere bağlı mortalitenin artmış olduğu kesin olarak gösterilememiştir (59). PKOS ile meme ve over kanseri arasındaki ilişiki olduğu gündeme gelmişse de uzun dönem retrospektif takip çalışmalarında PKOS hastalarında bu kanserlerin gelişme riskinde veya neden oldukları mortalitede artış bulunmamıştır (89). Meme kanseri ile PKOS’ un ilişkisini araştıran çalışmaların çoğu kesin bir pozitif ilişki göstermek için yetersizdir.
ETYOPATOGENEZ:
Etyoloji kesin olarak bilinmemekle birlikte PKOS, genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimiyle ortaya çıkan, sık görülen kompleks bir hastalıktır. Sendromun fizyopatolojisinde gonadotropin dinamiğinde değişiklikler, steroidogenez defekti, insülin salınım ve etki bozuklukları ile genetik faktörler rol oynamaktadır (91).
DHEA-S düzeyleri, bazal ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) uyarısına artmış adrenal androjen sekresyon yanıtında genetik faktörler önemlidir (122).
İnsülin Salınım ve Etki Bozuklukları: İnsülin direnci ve beraberinde kompansatuvar hiperinsülinemi hem zayıf hem de obez PKOS hastalarında sık görülen bir bulgudur (35). İlk kez 1980 yılında Burghen ve arkadaşları tarafından obez PKOS’ lu hastalarda hiperandrojenizm ve hiperinsülinemi arasında pozitif lineer korelasyonun bulunmasının ardından birçok çalışmada zayıf ve obez PKOS hastalarında insülin direnci gösterilmiştir. Ancak ne obezite ne de tek başına androjen fazlalığı PKOS’ da görülen insülin etki bozukluğunu açıklayamamaktadır (21, 37). Ayrıca, her PKOS hastasında insülin direnci olmadığı gibi, insülin direnci ölçümü PKOS tanı kriterleri arasında yer almaz (121). PKOS’ ta insülin direnci ve hiperinsülinemi overde teka hücrelerinde androjen sentezini arttırarak ve ayrıca karaciğerde sex hormon binding globulin (SHBG) düzeyinde azalmaya yol açarak serbest testosteron düzeyini arttırmaktadır. Bu da overlerden yumurta salınımını önleyerek infertiliteye neden olmaktadır. Ayrıca yüksek insülin seviyeleri androjenlerin östrojene dönüşümlerini arttırarak direk kilo alımına ve overlerde kist oluşumuna neden olur. İnsülin direncini inceleyen bazı çalışmalarda, insülinin reseptöre bağlanması normal iken, insülin aracılı glukoz transportunun azalmış olduğu (artmış serin fosforilasyonuna bağlı reseptör defekti) saptanmıştır (37). PKOS’ a neden olan insülin rezistansı iki farklı şekilde gelişebilir. Bunlardan ilki, insülin rezistansı insülin reseptör bölgelerini veya hücredeki giriş kapılarını azaltabilmektedir. Normal insana göre PKOS’ lu hastalarda hücre başına düşen reseptör sayısı 4 kat daha azdır. Böylece hücre içine glikoz girişi azalmakta ve kandaki glikoz miktarı artmaktadır. Bu fazla şeker de karaciğere yollanır ve burada yağa dönüştürülür ve depo edilir. Bu olaylar sonucunda kilo alımı ve obezite gelişmekte, bunlar da PKOS gelişmesinde anahtar rol oynarlar. İkinci yolda ise direk olarak insülin düzeylerindeki artış insülin rezistansına neden olur. Bu olaylar da PKOS’ a neden olmaktadır. Sağlıksız yaşam biçimi ve genetik sebeplerden dolayı pankreasta fazla miktarda insülim üretimi olur. Hücre bu fazla insülin salınımından dolayı kendini korumak için insülin reseptör sayısını azaltma gereği duyar. Bu da kandaki insülin seviyesini arttırarak PKOS’ lu hastalarda hormon seviyelerinde dengesizliğe yol açmaktadır.
Genetik Faktörler: PKOS hastalarında ailesel kümelenmenin olması genetik özelliklerin araştırılmasına neden olmuştur (72). PKOS’ lu hastaların anne ve kız kardeşlerinde hiperandrojenizm ve menstruel disfonksiyonun artmış sıklıkta bulunmasının yanısıra, baba ve erkek kardeşlerde de serum androjen düzeyleri artmış
gibi görünmektedir (120). Ayrıca tüm 1. derece yakınlarında insülin direnci ve değişik derecelerde glikoz homeostaz bozukluklarının görülme riski yaş ve vücut kütle indeksi (BMI) eşleştirilmiş sağlıklı kontrollere göre artmıştır (120). Olası genetik defektlerin incelendiği değişik çalışmalar sendromun kompleks, poligenik bir bozukluk olduğunu göstermektedir (55, 72). PKOS’ taki ailesel kümelenmenin araştırılması amacıyla daha çok over morfolojisi, menstruel düzensizlikler, hiperandrojenizmin semptomları ve hiperandrojenemi gibi konularda araştırmalar yapılmıştır (65, 73). Cooper ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada oligomenore ve polikistik over insidansının 1. derece akrabalarda kontrollere göre daha yüksek olduğu bulunmuştur (28). Ferriman ve Purdie oligomenore olan ve olmayan, hirsutizm görülen bir çalışma grubunda yaptıkları araştırmada 1.derece akrabalarda yüksek hirsutizm prevalansı, oligomenore ve infertilite olgularına rastlamışlardır (58). NIH kriterlerine göre, PKOS hastalarının annelerinde ve kız kardeşlerinde bu hastalığın görülme riski sırasıyla %24 ve %32’dir (65). Türkiye’ deki bu oranın yapılan bir çalışmada % 8 ve %16 olduğu bulunmuştur (120).
Olası genetik defektlerin incelendiği değişik çalışmalar sendromun kompleks, poligenik bir bozukluk olduğunu göstermektedir. PKOS’ un etyopatogenezinde önemli olabileceği düşünülen aday genlerinin seçiminde 2 yaklaşım söz konusudur.
PKOS’ da fonksiyonları değiştiği bilinen proteinleri kodlayan genler (Tablo 2.1.).
PKOS’ da fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek proteinleri kodlayan genler (70).
Yaptığımız literatür taramasında PKOS’lu kadınlarda TNFα (-308) ve IL-6 (- 174) gen polimorfizmi ile ilgili az sayıda araştırmalar yapılmış olmasına rağmen, bu sonuçlar oldukça karmaşıktır (32, 80, 116). PKOS’lu kadınlarda IL-10 (-1082) gen polimorfizmi ile ilgili bir araştırmaya ise rastlamadık. TNFα ve IL-6 gen polimorfizminin ve PKOS’ un bazı klinik bulguları arasında bir ilişki olduğu gösterilmiştir. TNFα (-308) A, IL-6 (-174) G ve IL-10 (-1082) G allellerinin mevcudiyeti transkripsiyonal aktivitede ve ilgili sitokinin plazma düzeylerinde artışa neden olmaktadır.
TÜMÖR NEKROZİS FAKTÖR a
Tümör nekrozis faktör alfa (TNFα), kaşektin olarak da adlandırılan ve 17-70kDa ağırlığında bir sitokindir (78). Homotrimer bir yapıya sahip olan TNFα, özellikle makrofajlar ve monositler olmak üzere fibroblast, endotel hücreler, adipositler, B hücreleri gibi birçok hücre tarafından üretilmektedir (1,6,22). 6p21.3 kromozomu üzerinde bulunan gen tarafından üretilen TNFα, ileri derecede pleiotropik (tek bir sitokin birden çok hücre tipi üzerine etkili olabilir) bir sitokindir.
TNFα’ nın Etkileri : TNFα özellikle lipit metabolizması, koagülasyon, insülin rezistansı ve endotel üzerine etki etmektedir.
IL-1 ve IL-6 ile birlikte inflamatuar olaylarda sitokin kaskadını harekete geçirmede rol oynar. Ayrıca damar endotel hücrelerinde vasküler hücre adhesyon molekül 1 (VCAM1), intersellüler adhesyon molekül 1 (ICAM1) ve E-selektin gibi adhesyon moleküllerinin sentezini arttırmaktadır (33). Bu özelliklerinin yanı sıra apoptozisi indükler, akut inflamasyon sırasında fagositlerin aktivasyonunu ve karaciğerde akut faz reaktanlarının sentezi ve salgılanmasını arttırır (18). Metabolik etkileri ise ; yağ dokusundan trigliseritlerin dolaşıma salınmasını arttırır, iskelet kasında proteinlerin yıkımını uyarır, anaerobik glikolizi uyarır ve septik şokun patogenezinde etkilidir(ateşin yükselmesi, hemodinamik karaciğer ve koagülasyon fonksiyon bozuklukların gelişmesine aracılık eder) (18). TNFα, interferon gama (IFNγ) ile birlikte immün cevap üzerine güçlü bir etkiye sahiptir.
TNFα’nın biyolojik etkisi konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük konsantrasyonlarda (~10-9M) TNFα, lokal olarak immüno-inflamasyonun otokrin ve parakrin düzenleyicisidir (14). Yüksek konsantrasyonlarda TNFα, endokrin hormon gibi etki etmektedir. Ayrıca IFNγ, TNFα’ nın birçok biyolojik etkisini hızlandırmaktadır.
Diğer Sitokinlerle İlişkisi : TNFα inflamatuar cevabın aktivasyonunda ve regülasyonunda ana rol oynamaktadır. TNFα; IL-1, IL-6, IL-8 ve IL-10’nun sentezini
7p21-14 kromozomu üzerinde bulunan IL-6 genin ürünü olan IL-6 homodimer bir yapıya sahiptir.
İnterlökin 6’nın Etkileri: IL-6 multifonksiyonel ve pleiotropik etkili bir sitokindir. Hepatositlerde akut faz cevabın artmasında rol oynar. Bu etkisini CRP, haptoglobin, fibrinojen ve proteaz inhibitörleri gibi akut faz proteinlerinin üretimini arttırarak gereçekleştirir. T lenfositlerinde IL-10 üretimi, IL-6 tarafından indüklenmektedir (30). IL- 6 endotel hücrelerde intersellüler adhesyon molekülü 1 (ICAM-1) ve VCAM-1 ile E-selektin moleküllerinin ekspresyonunu arttırarak endotel hücrelerinin lenfositlere yapışmasını arttırır.
IL-6 hipofize etki ederek ACTH salınımını indükler ve ayrıca direk olarak adrenal bezlere etki ederek glikokortikoid üretimine neden olur (14).
Bu etkilere ilaveten, IL-6 hematopoiezi arttırır, ateşin yükselmesine neden olur, böbrek mesengial hücre proliferasyonunu arttırır, doğal ve kazanılmış immünitede rol alır, kazanılmış immünitede B hücrelerinden antikor üretimini indükler, hepatosit ve sinir hücrelerinin rejenerasyonunda etkilidir, embriyonel gelişim ve fertilite de önemlidir (14).
Diğer Sitokinlerle İlişkisi: IL-6 endotel hücrelerinde IL-1 ve TNFα’ın sekresyonunu arttırır. IL-1 ve TNFα da IL-6 sekresyonunu arttırmaktadır. IL-10 post- transkripsiyonel mekanizma ile IL-6’ nın sentez ve sekresyonunu baskılamaktadır.
Etki Mekanizması: İnterlökin-6 molekülü reseptörü olan gp130 reseptörüne bağlandıktan sonra JAK/STAT yolu aktiflenir. Daha sonra JAK ligandı üzerinde bulunan fosfor atomu SHP2 domainine aktarılarak SHP2’ nin aktiflenmesi sağlanır. Bundan sonra sırasıyla SOS, Ras, Raf, MEK ve MAPK yoluyla ilgili genin transkripsiyonu yapılır. Bu birinci yoldur. Diğer bir yolda ise JAK molekülü yine fosfat grubunu STAT ligandına verir ve iki STAT molekülü birbirine bağlanarak ilgili genin transkripsiyonunu başlatır (14).
3. GEREÇ VE YÖNTEM
HASTA VE KONTROL ÖRNEKLERİ
Çalışma İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurulu’ nun 28.08.2006 tarih ve 1750 sayılı kararınca onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm hasta ve kontroller çalışma hakkında bilgilendirilerek yazılı izinleri alınmıştır.
Çalışmaya İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalına başvuran ve polikistik over sendromu tanısı konmuş 97 hasta (yaş ortalaması 24.5±5.0 yıl) çalışma grubuna dahil edildi. Kontrol grubu 95 sağlıklı premenopozal kadınlar (yaş ortalaması 27.8±4.1 yıl) tarafından oluşturuldu.
PKOS tanısı koymak için kullandığımız kriterler:
Kronik oligomenore (<8 siklus/yıl) ve/veya hirsutizm.
Ultrasonografide inci kolyesi tarzında dizilmiş 10’dan fazla 2.8 mm’ lik foliküller.
LH/FSH oranının 1.5 veya üzerinde olması.
Artmış kan androjen düzeyleri.
Yukarıda sayılan kriterlerden en az 2’nin mevcut olması, PKOS tanısını koymak için yeterli idi (Rotterdam 2003 Kriterleri).
İnsülin direncini değerlendirmek için kullandığımız kriterler:
Açlık glikoz (mg/dL) / Açlık insülin (µU/mL) oranı
HOMA (Homeostazis model of assesment) indeksi Açlık insülin (µU/mL) X Açlık glikoz (mg/dL)
405
Çalışma dışı bırakma kriterleri:
Son 6 ay içinde herhangi bir nedenle steroid ya da seks hormonları içeren bir ilaç alanlar.
Son 6 ay içinde hirsutizm ile ilişkili olduğu bilinen herhangi bir ilaç alanlar.
Hiperprolaktinemisi olanlar.
Konjenital adrenal hiperplazisi olan veya 17α-hidroksiprogesteron düzeyi yüksek olanlar.
Herhangi bir sistemik hastalığı olanlar.
Tiroid hastalığı olan veya TSH, T3, T4 değerlerinde anormallik saptananlar.
Hiperandrojenemiye neden olabilecek fonksiyonel tümörü olanlar.
Vücut kitle indeksi (BMI) 25’ten büyük ve 18’den küçük olan PKOS’ lu olgular.
Sigara kullananlar.
Kontrol grubu en az 1 normal gebelik süreci geçirmiş ve sağlıklı çocuk sahibi olan, menstrüel irregularite ve/veya hirsutizm şikayeti olmayan sağlıklı kadınlardan oluşturuldu. Çalışma grubunun çalışma dışı bırakılma kriterleri kontrol grubunda da uygulandı.
Kontrol grubundaki kadınlardan en az 12 saatlik açlık sonrası sabah saat 800-1000 arasında venöz kan örnekleri EDTA.K2 ve düz kuru tüplere alındı. Kontrol grubunda kan alma işlemi menstrüel siklusun 3. ve 5. günleri arası olan erken foliküler fazda gerçekleştirildi. Kronik anovulasyonu olan PKOS’ lu kadınlardan ise kan alma işlemi herhangi bir zamanda yapıldı. Alınan serum/plazma örneklerinde; rutin biyokimyasal parametreler olan açlık kan glikozu, trigliserit, kolesterol, HDL, LDL konsantrasyonlarının ölçümü 1800DPP Roche otoanalizörü ile; rutin hormonal parametreler olan LH, FSH, PRL, TSH, FT3, FT4, total testosteron, DHEA-S ve insülin ölçümü moduler EEE Electrod Elecsys Roche otoanalizörü ile yapıldı.
LH/FSH, Açlık glikoz/Açlık insülin oranları , HOMA ve vücut kütle indeksleri hesaplandı.
GEREÇLER
Kullanılan Aletler:
Elektroforez güç kaynağı (EC250 – 90 Electrophoresis Power Supplly, Thermo Electron Corp., USA).
UV transilluminatör ve görüntüleme sistemi (VilberLourmant, France).
Elektroforez cihazı (Serva BlueLine Horizontal Submarine Electrophoresis Chamber, Germany).
Mikrosantrifüj (Biofuge, Heraus Instruments, Germany).
PCR cihazı (Techne TC412 Termal Cycler, Barloworlal Scientific, Cambridge, UK).
pH metre (HANNA Instruments, Portugal).
Otomatik pipet takımı (Nichipet EX, Japan).
Su banyosu (Nüve BM 101, Türkiye).
Vorteks (IKA MS2 Minishaker, USA).
Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı (IKA Laborteeknik, USA).
Hassas terazi (Scaltec SBAC<11, Germany).
Otoklav (Hirayama, HVE-50, Japan).
ELISA cihazı (ELx800, BioTek Instruments, USA).
TNFα (-308 G/A), VE IL-6 (-174 G/C) GEN POLİMORFİZMLERİNİN TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER
Periferik Kan Lökositlerinden DNA İzolasyonu
DNA’ nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile Çoğaltılması
PCR – TNFα (-308) ve IL-6 (-174)
PCR ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi
PCR Ürünlerinin Uygun Kesim Enzimleriyle Kesilmesi (RFLP)
NcoI enzimi ile kesim (TNFα -308)
Hsp92II enzimi ile kesim (IL-6 -174)
Kesim Ürünlerinin Agaroz Jel ve Elektroforez ile Görüntülenmesi
Genotipin Saptanması
C.I Periferik Kan Lökositlerinden DNA İzolasyonu
Ayıraçlar
Kırmızı Kan Hücrelerini Parçalama Tamponu (Red Blood Cell Lysis Buffer – RBLB).
NH4Cl : 8.74 g KHCO3 : 1 g
0.5M EDTA : 200 µl
NH4Cl ve KHCO3 mezürde 800 ml bidistile suda çözüldü. 200 µl 0.5M EDTA eklendi. 1N NaOH ile pH: 7.4 e ayarlandı. Bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
Beyaz Kan Hücrelerini Parçalama Tamponu ( Wright Blood Cell Lysis Buffer – WBLB).
4M NaCl : 10 ml 0.5M EDTA : 20 ml
Mezür içine konulup bidistile su ile 400 ml’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
%10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Çözeltisi SDS : 10 g
Tartılan SDS tozlarını kaldırmamaya dikkat ederek behere konuldu. Bidistile su ile 90 ml’ye tamamlandı. 56°C su banyosunda bekletilerek çözüldü. pH: 7.2’ ye HCl ile ayarlandı. Bidistile su ile 100 ml’ ye tamamlandı. 0.22 µm’ lik filtreden geçirilerek sterilize edildi.
Proteinaz K (20 mg/ml)
0.2 g Proteinaz K 10 ml bidistile suda çözüldü. 1 ml’ lik porsiyonlarda -20°C’ de saklandı.
9.5M Amonyum Asetat Çözeltisi Amonyum Asetat : 73.226 g
Beher içine alınıp, üzerine 100 ml bidistile su konuldu. Yaklaşık 40°C’ de manyetik karıştırıcıda çözüldü. 0.22 µm filtreden geçirilerek sterilize edildi.
Tris – EDTA (TE) Tamponu (pH: 8.0) 1M Tris – HCl : 10 ml (A)
0.5M EDTA : 10 ml (B)
Mezür içine aktarıldı ve bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
1MTris – HCl Tamponu Tris – Baz : 121.1 g HCl : 42 µl
Mezür içine aktarıldı ve bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcı aracılığıyla çözüldü.
0.5M EDTA (pH: 8.0) EDTA : 186.1 g
Beher içine alındı ve bidistile su ile 800 ml’ ye tamamlanıp manyetik karıştırıcı aracılığıyla çözüldü. Yaklaşık 20 g NaOH pelletleri ile pH: 8.0’ e ayarlandı ve bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
4M NaCl Çözeltisi NaCl : 233.6 g
Mezür içine konuldu, bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcı aracılığıyla çözüldü. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
İşlem
10 ml venöz kan steril falkon tüplerine konularak 1:3 oranında RBLB çözeltisi eklendi, +4°C’ de 10 dakika bekletildi ve +4°C’ de 1500rpm’ de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatant atıldı ve pellet üzerine 30 ml RBLB eklenip +4°C’ de 1500rpm’ de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatant tekrar atılarak pellet üzerine 10 ml WBLB, 500 µl %10’ luk SDS ve 50 µl proteinaz K eklendi ve 56°C’ de gece boyu inkübe edildi. İnkübasyon sonrası 4000 µl Amonyum asetat ilave edildi. -20°C’ de 10 dakika bekletildi, daha sonra +4°C’ de 4000rpm’ de 45 dakika santrifüj edilerek proteinler çöktürüldü. Süpernatant steril falkon tüpüne alındıktan sonra üzerine 1:1 oranında %99’ luk absolü alkol eklendi. Ayrı bir ependorf tüpüne konmuş 500 µl %70’ lik alkol üzerine falkon tüpündeki süpernatantın üstünde toplanmış olan DNA transfer edildi,
+4°C’ de 14000rpm’ de santrifüj edildi. Süpernatant döküldü, dipte kalan DNA pelleti 56°C’ de etüvde kurutuldu. Kuruyan pellet üzerine 500 µl TE eklendi, 56°C’ de etüvde 1 saat bekletildi. Böylece DNA’ nın çözülmesi sağlandı. Elde edilen DNA örnekleri kullanılıncaya kadar -20°C’ de saklandı.
DNA miktar tayini
Örneklerin miktarını ve saflığını tayin etmek için 2 µl DNA örneği üzerine 98 µl TE tamponu konularak, optik dansiteleri (OD) spektrofotometrede 260 ve 280 nm dalga boylarında ölçüldü. 260 ve 280 nm’lerdeki ölçüm değerlerinin birbirine oranı (OD260/OD280) nükleik asidin saflığı hakkında bir tahmin yapmamıza olanak verir. Saf DNA ve RNA örneklerinin OD260/OD280 oranları sırasıyla 1.8 ve 2.0’dır.
PCR’ ın temel bileşenleri:
Kalıp DNA,
Öncü DNA molekülleri (primerler),
Deoksi ribonükleozid trifosfatlar (dNTP) – dATP, dGTP, dTTP ve dCTP,
Mg2+,
Uygun tampon,
DNA polimeraz (Taq polimeraz) – Thermus aquaticus bakterisinden elde edilir.
PCR, değişik sıcaklıklarda gerçekleşen 3 basamağın döngüler halinde tekrarlanması ile oluşur.
PCR’ ın basamakları:
Kalıp DNA’ nın denatürasyonu. 92-95°C’ de gerçekleşen bu basamakta karışımdaki kalıp DNA iplikçiklerinin birbirinden tamamen ayrılması sağlanır.
Primerlerin kalıp DNA’ ya bağlanması annealing. 50-64°C’ de gerçekleşen bu basamakta primerlerin kalıp DNA üzerinde uygun yerlere bağlanması sağlanır.
Yeni DNA zincirlerinin sentezlenmesi elongation. 72°C’ de gerçekleşen bu basamakta ortamda bulunan dNTP’ ler Taq polimeraz enziminin aracılığıyla primerlerin 3’ ucuna eklenerek kalıp DNA dizisinin kopyası sentezlenir (Şekil 3.1).
Bu 3 basamak bir döngüyü oluşturur ve her tekrarlanışında iki primer arasında kalan özgün DNA parçasının her iki zincirinin birer kopyası çıkarılmış olur. PCR’ ın net sonucu, n sayıda tekrarlanan döngülerin sonucunda reaksiyon teorik olarak 2n miktarında özgün primer çiftleri ile çoğaltılmış çift sarmallı DNA molekülünü içerir.
TNFa (-308) ve IL-6 (-174) gen bölgelerinin çoğaltılmasında kullanılan primerler ve PCR koşulları:
a. TNFa (-308)
F: 5’ – AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT – 3’
R: 5’ – TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG – 3’
Bu pirmerler 107 bç’ lik PCR ürününün oluşmasını sağlamaktadır.
b) IL-6 (-174)
F: 5’ – TTG TCA AGA CAT GCC AAG TGC T – 3’
R: 5’ – GCC TCA GAG ACA TCT CCA GTC C – 3’
Bu primerler 304 bç’ lik PCR ürününün oluşmasını sağlamaktadır.
Tablo 3.1. TNFa (-308) ve IL-6 (-174) genlerinin PCR ortamı (final hacim
30ml)
Stok Solüsyonun
Molaritesi
Çalışma Ayıracının
Molaritesi
Final
Molarite
PCR Tamponu
10X
1X
MgSO4
20mM
1.9mM
Primerler
100mM
10mM
0.33mM
dNTP’ ler
100mM
2mM
0.2mM
Taq Polimeraz
5U/mL
1U
DNA
~50ng
TNFa (-308) ve IL-6 (-174) genleri için amplifikasyon ısıları:
Başlangıç `melting` (erime) basamağı = 94°C’ de 3 dakika
94°C’ de 50 saniye
56°C’ de 50 saniye 35 döngü 72°C’ de 50 saniye
Final uzatma basamağı = 72°C’ de 10 dakika.
C.III PCR Ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforezi ile Görüntülenmesi
Kullanılan Çözeltiler
0.5M EDTA (pH: 8.0) EDTA : 186.1g
Beher içine alındı ve bidistile su ile 800ml’ ye tamamlanıp manyetik karıştırıcı aracılığıyla çözüldü. Yaklaşık 20g NaOH pelletleri ile pH: 8.0’ e ayarlandı ve bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
50X TAE Tamponu Tris baz : 242g
Glasial asetik asit : 57.1ml 0.5M EDTA : 100ml
Bir beher içine alınan Tris üzerine bidistile su eklenerek manyetik karıştırıcı aracılığıyla çözüldü, glasial asetik asit ve EDTA eklendi, ve bidistile su ile 1L’ ye tamamlandı. 120°C’ de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
1X TAE Tamponu (pH: 8.0)
50X TAE tamponu bidistile su ile 50 kat sulandırılarak hazırlandı.
Etidyum Bromür Çözeltisi (10mg/ml)
6X Agaroz jel yükleme tamponu (BioBasic Inc, Canada)
%30 Gliserol
%0.12 Bromfenol mavisi
%0.12 Ksilen siyanol
%3 Agaroz jel hazırlanması
3g agaroz tartılıp bir erlenmayer içine kondu, üzerine 100ml 1X TAE tamponu eklendi. Mikrodalga fırında kaynatıldı. Üzerine 2ml etidyum bromür çözeltisi eklendi, karıştırıldı ve jel yatağına döküldü. Jel soğup katılaştıktan sonra tanka yerleştirildi. Üzerine 1X TAE tamponu eklendi.
Elektroforez
PCR ürünleri (10ml) 1 ml agaroz jel yükleme tamponu ile karıştırılarak jeldeki kuyucuklara yüklendi. 85 voltta (200mA) yürütüldü. Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel UV ışık altında gözlendi.
C.IV PCR Ürünlerinin Uygun Kesim Enzimleriyle Kesilmesi (RFLP)
Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism)
RFLP-PCR DNA’ daki tek nükleotid değişikliklerin saptanmasında kullanılan bir yöntemdir. Yöntemin prensibi, tanıma bölgesini ortadan kaldıran veya yeni bir tanıma bölgesi oluşturan DNA’yı küçük parçalara kesen restriksiyon enzimlerinin kullanılmasına dayanır. Restriksiyon enzimi DNA molekülünü kesmesine veya kesmemesine bağlı olarak, sonuçta kişiden kişiye değişiklik gösteren farklı uzunlukta DNA parçaları ortaya çıkar. İşte, DNA’nın restriksiyon enzimleriyle kesimi sonrasında oluşan fragmanların boyutlarındaki farklılıklar RFLP olarak tanımlanır.
NcoI (10U/ml, Takara BioInc, Japan) Restriksiyon Enzimi ile Kesim TNFa (-308)
10x Restriksiyon enzimi tamponu 3ml Steril su 6.7ml
NcoI 0.3ml
PCR ürünü 20ml
Karışım 37°C’ de 4 saat inkübe edildi.
Hsp92II (10U/ml, Promega, USA) Restriksiyon Enzimi ile Kesim
IL-6 (-174)
10x Restriksiyon enzimi tamponu 1.7ml Sterilize su 6.7ml
BSA (10mg/ml) 0.08ml
Hsp92II 0.5ml
PCR ürünü 20ml
Karışım 37°C’ de gece boyunca inkübe edildi.
Kontrol Grubunda TNFα (-308), IL-10 (-1082) ve IL-6 (-174) Genotipine Göre Klinik ve Laboratuvar Bulguları
TNFα (GG) ve (GA+AA) genotipine sahip kontrollerde saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri arasındaki istatiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmadı.
IL-10 (GG) ve (GA+AA) genotipine sahip kontrollerde saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı.
IL-6 (GG) ve (GC+CC) genotiplerine sahip kontrollerde saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri karşılaştırıldığında, (GC+CC) genotipinde glikoz, HOMA ve LDL-kolesterol değerleri anlamlı olarak düşük; glikoz/insülin oranı ve HDL- kolesterol değerleri ise anlamlı olarak daha yüksek olduğu bulundu (Tablo 4.9).
PKOS Grubunda TNFα (-308), IL-10 (-1082) ve IL-6 (-174)
Genotipine Göre Klinik ve Laboratuvar Bulguları
TNFα (GG) ve (GA+AA) genotipine sahip PKOS’ lu kadınlarda saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri arasında istatiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmadı.
IL-10 (GG) ve (GA+AA) genotipine sahip PKOS’ lu kadınlarda saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı.
IL-6 (GG) ve (GC+CC) genotipine sahip PKOS’ lu kadınlarda saptadığımız klinik ve laboratuvar parametreleri karşılaştırıldığında, (GC+CC) genotipinde glikoz, HOMA, kolesterol, trigliserit ve LDL-kolesterol değerleri anlamlı olarak düşük; glikoz/insülin oranı ve HDL-kolesterol değerleri ise anlamlı olarak daha yüksek bulundu (Tablo 4.10).
Tablo 4.10. Polikistik over sendromu (PKOS) hastalarında TNFα (-308), IL-10 (-1082) ve
IL-6 (-174) genlerinin genotip dağılımlarına göre klinik ve laboratuar bulguları (ortalama±SD).
TNFα (-308)
IL-10 (-1082)
IL-6 (-174)
GG
(n=78)
GA+AA
(n=19)
GG
(n=15)
GA+AA
(n=82)
GG
(n=59)
GC+CC
(n=38)
BMI
23.59±1.64
22.86±2.54
23.01±2.39
23.53±1.75
23.93±1.65
22.70±1.93
Glikoz
87.00±9.40
90.05±16.30
85.26±8.43
88.02±11.46
90.15±11.02
83.63±10.00**
İnsülin
11.78±4.64
12.16±4.10
11.34±4.35
11.95±4.57
13.53±4.31
9.24±3.52
Glikoz/insülin
8.66±3.71
8.23±2.98
8.46±2.86
8.60±3.70
7.66±3.54
9.99±3.16*
HOMA
2.59±1.16
2.77±1.09
2.43±1.09
2.66±1.15
3.06±1.07
1.94±0.91*
LH
10.64±7.65
14.83±8.40
12.11±9.36
11.34±7.71
11.49±8.95
11.42±6.15
FSH
6.15±2.67
7.64±7.02
5.56±2.28
6.60±4.13
6.93±4.62
5.68±2.29
TSH
2.23±1.14
1.86±0.91
2.34±1.18
2.12±1.09
2.18±1.09
2.12±1.13
FT3
4.75±0.96
4.66±0.87
5.10±0.78
4.66±0.95
4.65±0.97
4.86±0.88
FT4
14.20±2.38
14.01±2.14
13.96±2.76
14.20±2.25
14.17±2.40
14.15±2.24
Östradiol
68.16±46.09
65.28±38.62
77.94±47.48
65.70±44.04
64.16±47.10
72.93±40.30
Progesteron
0.64±0.30
0.74±0.34
0.59±0.19
0.67±0.32
0.62±0.26
0.72±0.37
Prolaktin
13.95±6.93
16.37±6.52
15.95±8.57
14.15±6.55
13.71±6.33
15.53±7.62
Testosteron
0.88±0.31
0.96±0.39
0.80±0.41
0.91±0.31
0.89±0.31
0.90±0.36
DHEAS
213.95±60.15
216.22±48.05
218.85±55.60
213.57±58.41
218.30±58.32
208.33±57.06
Kolesterol
192.32±35.85
179.42±31.19
189.93±29.62
189.76±36.30
200.10±38.55
173.78±21.31*
Trigliserit
134.47±65.64
121.26±70.31
111.80±66.17
135.56±66.20
148.18±71.01
106.57±49.59**
HDL-
kolesterol
50.36±16.15
52.78±15.84
58.16±19.95
49.50±14.98
42.85±11.88
63.23±13.67*
LDL-
koesterol
112.66±39.37
104.57±31.25
102.92±38.77
112.57±37.79
127.08±33.11
86.23±31.09*
HOMA= Homeostasis Model of Assesment
Genotipler arasındaki istatiksel değerlendirmeler Mann-Whitney U testi ile yapıldı.
* p< 0.001; ** p< 0.01
TARTIŞMA
PKOS tüm kadınların %5-10’nu etkileyen ve kadın infertilitesinin en sık görülen nedenlerinden biridir (9, 68). PKOS’ un etyolojisi kesin olarak bilinmemektedir. Bu endokrin hastalığın genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimiyle meydana geldiği öne sürülmektedir (49, 70).
Son yıllarda PKOS gelişmesinde anormal sitokin üretimi ve TNFa, IL-6 gibi pro-inflamatuar, ve IL-10, IL-18 gibi anti-inflamatuar sitokinlerin arasındaki bozulmuş dengenin de etken olabileceği söylenmektedir (3, 5, 80). Sitokinler normal gebeliğin sürdürülmesi, immünolojik ve inflamatuar reaksiyonların regülasyonu gibi olaylarda önemli rolü olan güçlü mediatörlerdir (20, 84). Plasenta, amnion, decidua gibi gestasyonel dokularda, corpus luteum ve over granuloza hücrelerinde birçok farklı sitokin üretilmektedir (20, 84). Bununla birlikte sitokinler, endotel bütünlüğünün korunması ve normal endotel fonksiyonlarının kontrolünde ana role sahiptir (3). TNFa, IL-6 ve IL-10 gibi sitokinlerin plazma düzeyleri, üretiminden sorumlu olan genlerin promotör bölgelerindeki tek nükleotid polimorfizmi ile yakından ilgili olduğu öne sürülmektedir. TNFa (-308) A (69) IL-6 (-174) G (45, 114) ve IL-10 (-1082) G (111)
allellerinin mevcudiyeti yüksek transkripsiyonel aktivite ve yüksek plazma sitokin düzeyleri ile ilgilidir.
Yapmış olduğumuz literatür taramasında PKOS’ lu kadınlarda TNFa (-308 G/A) ve IL-6 (-174 G/C) gen polimorfizmi ile ilgili az sayıda çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, bu sonuçlar oldukça karmaşıktır (32, 80, 116). Genel kanı, TNFa (- 308 G/A) ve IL-6 (-174 G/C) genlerindeki tek nükleotid değişikliklerin PKOS gelişmesi için bir risk faktörü oluşturmamasıdır. Bizim bulgularımızdan da görüldüğü gibi kontrol ve PKOS gruplarının TNFa (-308 G/A) genotipi ve allel dağılımları birbirine yakındır. Bununla birlikte IL-6 (-174 G/C) geni polimorfizmi incelendiğinde, PKOS’ lu hasta grubuna ait dağılımlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında istatiksel olarak belirgin bir fark bulunmamış olmasına rağmen, G ve C allellerinin gruplar arasındaki dağılım farkı anlamlılık sınırındadır (p= 0.078). Bizim kontrol grubumuzdaki TNFa (-308) geninin A allel dağılımı (%11.1), EARS II çalışmasında kontrol grubu A allel dağılımlarına (Orta Avrupada %12, Güney Avrupada %13) çok yakındır (85). Ayrıca, yine bizim kontrol grubumuzdaki IL-6 (-174) geni G ve C allel dağılımları (%70.5 ve %29.5), İtalyan sağlıklı populasyonunda G ve C allel dağılımlarına (%71.1 ve %28.9) çok yakındır (7).
Literatür taramasında PKOS’ lu kadınlarda yapılan IL-10 (-1082 G/A) gen polimorfizmi ile ilgili bir çalışmaya rastlamadık. Tablo 4.7. ve 4.8.’den de görüldüğü gibi, IL-10 (-1082 G/A) genindeki tek nükleotid değişikliği de PKOS açısından bir risk faktörü gibi görünmemektedir. IL-10 (-1082) geni G ve A allel dağılımları (%45.3 ve
%54.7), İtalyan sağlıklı populasyonda G ve A allel dağılımlarına (%45.2 ve %54.8) çok yakındır (7).
PKOS, Diabetes Mellitus (81, 87) ve koroner arter hastalığı (8, 27, 118) için bir risk faktörü olarak benimsenmektedir. Bunun nedeni, PKOS’ un insülin direnci, obezite, dislipidemi ve hipertansiyon gibi belirtilerle yakından ilgili olmasıdır. Yukarıda sayılan risk faktörleri ve TNFa, IL-6 ve IL-10 plazma düzeyleri, ve bu sitokinleri kodlayan genlerin polimorfik varyantları arasında yakın bir ilişki söz konusudur. TNFa, IL-6 ve IL-10 ateroskleroz, koroner arter hastalığı, osteoporoz, preeklampsi, diabetes mellitus gibi birçok hastalığın etyopatogenezinde önemli rol oynamaktadır (43, 44, 79, 109).
Obez bireylerde yapılan bir çalışmada TNFa (-308) AA genotipine sahip kişilerde insülin ve HOMA değerleri daha yüksek, HDL değerlerinin ise daha düşük olduğu bulunmuştur (32). Bizim PKOS’ lu hastalarımızda (GA+AA) genotipi GG genotipi ile karşılaştırıldığında, insülin direnci parametreleri, lipid profili ve BMI arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. PKOS’ un obeziteyle yakından ilgili olmasına rağmen her iki çalışmanın farklı sonuçlarının nedeni muhtemelen bizim çalışmamızdaki PKOS’ lu kadınların genç ve normal kilolu (BMI’ leri 25kg/m2’ den daha düşük) olmasıdır.
K. Walch ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, IL-6 (-174 G/C) genindeki tek nükleotid değişikliğin PKOS gelişmesi açısından bir risk faktörü olmadığını ve C allelinin yüksek BMI, testosteron ve bozulmuş OGTT ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur (116). C allellinin obezite ile de yakından ilgili olduğu gösterilmiştir (17, 117). Buna karşın Fernandez ve arkadaşları İspanyol populasyonunda yaptığı çalışmada (41,42), G allelin insülin rezistansı ile glikoz değerlerini arttırdığı ve dislipidemiye neden olduğunu göstermiştir. Bizim bulgularımızdan da görüldüğü gibi hem PKOS hem de kontrol grubunda GG genotipine sahip kişilerde (GC+CC) genotipine kıyasla glikoz, HOMA ve lipid değerleri anlamlı olarak daha yüksek, GIR ve HDL değerleri ise anlamlı olarak daha düşüktür. Ayrıca, GG genotipine sahip kontrol ve PKOS’ lu kadınların parametreleri karşılaştırıldığında, PKOS grubunda insülin, HOMA ve trigliserit değerleri anlamlı olarak daha yüksek, GIR ve HDL değerleri ise daha düşük olduğu bulundu.
Riskli IL-6 (-174) G allelin varlığı artmış plazma IL-6 düzeylerine neden olduğu bildirilmiştir (45, 114). IL-6 geni ile Smad 4 proteini bağlayan elemanı kodlayan gen arasında kısmı bir homoloji söz konusudur (115). Smad 4, TGFβ ve activinin sinyalizasyon yolunda bir transkripsiyon faktörüdür. TGFβ ve activin ise çeşitli pro- inflamatuar moleküllerin ekspresyonunu inhibe etmektedir. Koruyucu C allelin varlığında bu yol aktiv, riskli G allelin varlığında ise bu yol baskılanmaktadır (115). Riskli G allelin varlığı muhtemelen TNFα ve IL-1β gibi pro-inflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu arttırarak çeşitli büyüme faktörleri ve adhezyon moleküllerinin sentezini arttırmaktadır (99, 110). Böylece PKOS’ da aterosklerotik değişim süreci başlatılmış olmaktadır ve belki de bu sendromun klinik belirtileri daha belirgin hale gelmektedir.
